MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
https://doi.org/10.47193/mafis.3612023010109
RESUMEN. En este estudio se determinó la presencia de diversos contaminantes en muestras de
sedimentos en el Río de la Plata y la Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya (ZCPAU, 35° S-
38° S). Además, se analizó la ocurrencia de genes alkB microbianos, utilizados como biomarcadores
funcionales para determinar el potencial de degradación de hidrocarburos a lo largo de este ambiente
marino. Se detectaron metales pesados en las estaciones UY1, RdP4 y AR2. El Cr se encontró en un
rango entre <5,0 y 20,7 mg kg-1, y el Pb entre no detectable (ND) y 26,0 mg kg-1. Tanto el Cd como
el Hg mostraron valores por debajo de los límites de detección (<0,2 mg kg-1 y <0,01 mg kg-1,
respectivamente). El Cu varió entre ND y 24,6 mg kg-1, y fue el único metal que sobrepasó los valo-
res recomendados por la ISQG (Interim Sediment Quality Guideline), en los niveles guía en sedimen-
tos para la protección de la biota (CCME, Canadian Council of Ministers of the Environment). Los
valores de hidrocarburos, atrazina, glifosato + AMPA (ácido aminometil fosfónico) y pesticidas estu-
vieron por debajo del límite de cuantificación, mientras que los PCBs (desde <20,0 a 77,7 μg kg-1)
excedieron el nivel de acción A de las “Recomendaciones para la Gestión del Material de Dragado
en los Puertos Españoles”. Se obtuvo ADN genómico microbiano purificado en ocho de las nueve
muestras analizadas y se logró la amplificación del gen catabólico alkB en las estaciones UY2, UY1,
RdP4, AR2 y AR1. Es necesario realizar estudios adicionales para evaluar el potencial de biodegra-
dación microbiana en esta área. Estas investigaciones representan un valioso aporte para evaluar el
impacto de las alteraciones antropogénicas sobre los ecosistemas marinos y para comprender los
mecanismos de la atenuación natural.
Palabras clave: Ambiente marino, contaminantes persistentes, genes catabólicos.
Contaminant monitoring and detection of alkB genes in the Argentine-Uruguayan Common
Fishing Zone
ABSTRACT. In this study, the presence of diverse pollutants in sediments samples was deter-
mined in the Río de la Plata and the Argentine-Uruguayan Common Fishing Zone (AUCFZ 35° S-
38° S). In addition, the occurrence of microbial genes alkB, used as functional markers, was ana-
lyzed in order to determine the hydrocarbon degradation potential along this marine environment.
Heavy metals were detected in sampling sites UY1, RdP4 and AR2. Cr was found in a range from
< 5.0 to 20.7 mg kg-1, and Pb from not detectable (ND) to 26.0 mg kg-1. Both Cd and Hg showed
values under detection limits (<0.2 mg kg-1 and <0.01 mg kg-1, respectively). Cu varied between
ND and 24.6 mg kg-1, and it was the only metal that overcame the values recommended by the ISQG
(Interim Sediment Quality Guideline), in the guide levels for biota protection in sediments (CCME,
Canadian Council of Ministers of the Environment). Hydrocarbons, atrazine, glyphosate + AMPA
(aminomethyl phosphonic acid) and pesticides values were under the quantification limits, while
75
*Correspondence:
silviap_ar@inidep.edu.ar
Received: 22 August 2022
Accepted: 19 December 2022
ISSN 2683-7595 (print)
ISSN 2683-7951 (online)
https://ojs.inidep.edu.ar
Journal of the Instituto Nacional de
Investigación y Desarrollo Pesquero
(INIDEP)
This work is licensed under a Creative
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NonCommercial-ShareAlike 4.0
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Marine and
Fishery Sciences
MAFIS
ORIGINAL RESEARCH
Monitoreo de contaminantes y detección de genes alkB en la Zona Común
de Pesca Argentino-Uruguaya
SILVIA R. PERESSUTTI1, * yPABLO A. ZORZOLI2
1Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP), Paseo Victoria Ocampo Nº 1, Escollera Norte, B7602HSA - Mar del
Plata, Argentina. 2Servicio de Hidrografía Naval, Av. Montes de Oca 2124, C1270ABV - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
ORCID Silvia R. Peressutti https://orcid.org/0000-0001-5691-0917
INTRODUCCIÓN
El Río de la Plata y la Zona Común de Pesca
Argentino-Uruguaya (ZCPAU) representa un
ambiente muy productivo, que sostiene pesquerí-
as artesanales y costeras tanto en la Argentina
como en Uruguay (Acha et al. 2008). En esta área
también se llevan a cabo pesquerías demersales
multiespecíficas asociadas a diferentes tipos de
flotas comerciales (Militelli et al. 2013), así como
a stocks de especies costeras que utilizan la zona
como área de reproducción y cría (Mianzan et al.
2001; Jaureguizar et al. 2003).
A pesar del gran flujo de masas de agua y el
poder de dilución de las aguas marinas y estuaria-
les, el ambiente del ZCPAU se ve afectado por un
aporte crónico de contaminantes originados por
las actividades industriales y de embarcaciones,
las cuales producen un impacto significativo
sobre estos ecosistemas (Venturini et al. 2015).
Existen varias fuentes de contaminación, como
derrames accidentales, desechos de refinerías
costeras, efluentes pluviales, tráfico de embarca-
ciones y actividades portuarias. Es ampliamente
reconocido que la polución por compuestos tóxi-
cos (hidrocarburos, metales pesados y pesticidas)
ha dañado océanos, mares y zonas costeras cons-
tituyendo una constante amenaza para la sustenta-
bilidad de los ecosistemas marinos (McGenity et
al. 2012). La contaminación crónica en ambientes
costeros da lugar a efectos adversos a diferentes
niveles de organización biológica. Estos com-
puestos pueden producir daños fisiológicos a con-
centraciones subletales y alteraciones genéticas
en peces y otros organismos marinos, como así
también se ha observado disminución de creci-
miento y fecundidad (White y Triplett 2002;
McGenity et al. 2012; Ernst et al. 2018). Además,
también se ha demostrado su bioacumulación con
posible transferencia a humanos vía alimentos de
origen marino (Morales-Caselles et al. 2008). En
estudios previos se ha detectado la presencia de
hidrocarburos de origen antrópico, pirogénico y
petrogénico (Colombo et al. 2004; Venturini et al.
2015), metales pesados y plaguicidas en sedimen-
tos obtenidos en el estuario del Río de la Plata y
en la ZCPAU (Carsen et al. 2005) (Figura 1).
También se encontraron metales pesados y pesti-
cidas en peces de esta zona (Colombo et al. 2000;
Cappelletti et al. 2006).
Por las características físico-químicas de estos
contaminantes, tienden a concentrarse en los
sedimentos de la zona donde fueron descargados,
transformándolos en potenciales sumideros de
compuestos tóxicos. Cuando la calidad de las
aguas mejora, por control de vertidos, la contami-
nación críptica en los sedimentos actúa como
fuente secundaria de polución a través de proce-
sos de erosión y/o transporte (Salomons y Brils
2004). Por esta razón, el Canadian Council of
Ministers of the Environment (CCME) recomien-
da niveles guía de los diferentes contaminantes en
sedimentos para la protección de la vida acuática
(CCME 2001), diferenciando entre los niveles de
polución que causan efectos crónicos, de los que
generan efectos agudos.
Una herramienta para la remediación de este
tipo de sumideros es el dragado de sedimentos y
su posterior reubicación (CEDEX 1994). Por otro
lado, los procesos de descontaminación de los
76 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
PCBs (from <20.0 to 77.7 μg kg-1) exceeded the action level A for the ‘Recommendations for the Management of Dredging Material
in Spanish Ports’. Purified microbial genomic DNA was obtained in eight from the nine analyzed samples, and the catabolic gen alkB
was amplified in sampling sites UY2, UY1, RdP4, AR2 and AR1. Further studies are needed to evaluate the microbial biodegradation
potential in this area. These researches mean a valuable input in order to investigate the impact of anthropogenic disturbances on marine
ecosystems and to understand the mechanisms of natural attenuation.
Key words: Marine environment, persistent contaminants, catabolic genes.
ecosistemas marinos dependen primariamente de
las comunidades microbianas presentes en el
ambiente (Leahy y Colwell 1990). Gracias al de-
sarrollo de nuevas técnicas moleculares, se han
realizado estudios en diferentes ambientes sobre
composición de comunidades bacterianas y genes
que codifican enzimas claves involucradas en la
degradación de contaminantes. Dentro de las
mezclas complejas de compuestos oleosos hidro-
carbonados, los alcanos constituyen más del 50%
de la fracción orgánica. Estos residuos son hidro-
carburos (HC) saturados con diferentes tamaños
moleculares y estructuras químicas, y muchos de
ellos son persistentes en el ambiente pudiendo
volverse recalcitrantes debido a sus moléculas no
polares químicamente inertes (Li et al. 2013).
Para las comunidades bacterianas degradado-
ras de alcanos, el gen alkB es considerado el
mejor biomarcador funcional, ya que codifica las
enzimas alcano monooxigenasas AlkB, que son
cruciales en las vías metabólicas involucradas en
la degradación de alcanos de cadena corta, media
y larga (< C10, C10-C16, C20-C40, respectiva-
mente) (Wang y Shao 2012). Estos genes se
encuentran ampliamente distribuidos y han sido
utilizados para la descripción de la composición
de comunidades degradadoras de alcanos y para
calcular la abundancia de bacterias degradadoras
de hidrocarburos en diversos ambientes (Smith et
al. 2013; Nie et al. 2014; Corti-Monzón et al.
2021).
Los clusters de genes alkB codifican todas las
proteínas necesarias para convertir los alcanos en
los correspondientes ácidos grasos, dotando a los
microorganismos con la habilidad de utilizar
alcanos como única fuente de carbono y energía
(Wang et al. 2022). Usualmente, existe un gen por
genoma, aunque en algunas especies se han halla-
do dos o más genes alkB redundantes (Whyte et
al. 2002). A pesar de que las secuencias de alkB
77
PERESSUTTI Y ZORZOLI: CONTAMINANTES Y GENES MICROBIANOS: CAMPAÑA VA1219
Figura 1. Localizaciones de sitios de muestreo en el Río de la Plata y la Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya (ZCPAU).
Puntos rojos: análisis microbiológico. Puntos negros: análisis químico y microbiológico.
Figure 1. Sampling sites locations in the Río de la Plata and the Argentine-Uruguayan Common Fishing Zone (ZCPAU). Red
dots: microbiological analysis. Black dots: chemical and microbiological analysis.
ZCPAU
W 62° 61° 60° 59° 58° 57° 56° 55° 54° 53° 52° 51°
S
34°
35°
36°
37°
38°
39°
Mar del Plata
Argentina
Uruguay
pueden ser muy divergentes, ellas comparten una
región conservada que permite el diseño de ceba-
dores aplicables para la amplificación de genes
filogenéticamente distantes (Kloos et al. 2006;
Viggor et al. 2013), permitiendo así la detección
de los mismos en ambientes contaminados.
El presente estudio fue llevado a cabo con el fin
de detectar la presencia de diversos contaminan-
tes en muestras de sedimentos obtenidas en el Río
de la Plata y la ZCPAU, así como la ocurrencia de
genes alkB en las comunidades microbianas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Entre los días 4 al 14 de diciembre de 2019 se
llevó a cabo una campaña de investigación multi-
disciplinaria de la Comisión Técnica Mixta del
Frente Marítimo (CTMFM) (35° S-38° S)
VA12/2019, denominada “Salud ambiental en la
Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya
(ZCPAU) en un escenario de Cambio Global”, a
bordo del buque BIP “Víctor Angelescu”
(INIDEP, Argentina). Se tomaron muestras de
sedimento a lo largo de tres transectas que inclu-
yeron nueve estaciones de muestreo, desde la
costa hacia el Frente Marítimo (Figura 1).
El muestreo se realizó mediante un extractor
tipo Snapper (EPA 2001). La extracción de mues-
tras para metales pesados se llevó a cabo con una
espátula de plástico realizando enjuagues de la
misma con agua del sitio de muestreo. Una vez
extraído el sedimento, se lo colectó en una bolsa
de polipropileno y se conservó a 4 ±2 °C hasta su
medición en el laboratorio de análisis químicos
ambientales Induser (Ciudad Autónoma de Bue-
nos Aires). Posteriormente, se efectuó un segundo
lance de Snapper para la extracción de muestras
destinadas a compuestos orgánicos, las cuales se
obtuvieron con una espátula de acero inoxidable,
enjuagada previamente con agua del sitio de
muestreo. Las mismas fueron acondicionadas en
papel de aluminio previamente muflado a 400 °C
utilizado como envase primario, y luego alojadas
en una bolsa de polipropileno y conservadas en
freezer (-18 ±2 °C) hasta su medición en el labo-
ratorio de análisis químicos ambientales Fares
Taie (Mar del Plata).
Para estudios microbiológicos se extrajeron
entre 100 y 200 g de muestras de sedimento que
fueron almacenadas en bolsas de polietileno y
refrigeradas a 4 ±2 °C hasta su procesamiento.
Detección de contaminantes
Los sedimentos extraídos para la determina-
ción de contaminantes fueron procesados según
las metodologías estándar o correspondientes a
cada elemento (Tabla 1).
Los resultados obtenidos se cotejaron con los
niveles guía de sedimentos para la protección de
la biota en ambientes marinos del CCME (2001)
y con las “Recomendaciones para la Gestión del
Material de Dragado en los Puertos Españoles”
(RGMD) (CEDEX 1994), para evaluar la calidad
del sedimento de la zona y sus posibles efectos
sobre la biota (Tabla 2).
La comparación de las concentraciones medi-
das de varios contaminantes asociadas a los sedi-
mentos con los valores guía de la CCME propor-
ciona una indicación básica sobre el grado de con-
taminación y el posible impacto en la ecología.
Las pautas consisten en niveles de efecto
umbral (ISQG/TEL, por sus siglas en inglés
Interim sediment quality guideline/threshold
effect levels) y niveles de efecto probable (PEL,
por sus siglas en inglés probable effect level),
siendo los TEL y PEL utilizados para identificar
tres rangos de concentraciones químicas con res-
pecto a los efectos biológicos. Si los valores se
encuentran por debajo del ISQG/TEL, se refiere
al rango mínimo dentro del cual rara vez ocurren
efectos adversos; valores entre el ISQG/TEL y el
PEL representa un rango dentro del cual ocurren
ocasionalmente efectos adversos y valores por
encima del PEL producen frecuentemente efec-
tos adversos.
78 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
Según las RGMD, los sedimentos que se
encuentran por debajo de los límites del nivel de
acción A, pueden ser vertidos sin perjuicio a la
flora y fauna, teniendo en cuenta solo los efectos
mecánicos. Los sedimentos cuyos valores sobre-
pasen el nivel de nivel de acción A pero sean infe-
riores al nivel de acción B son considerados con
baja probabilidad de efectos nocivos, por lo que
este tipo de material podrá ser vertidos de forma
controlada, y los mismos deben ser monitoreados
periódicamente. Aquellos sedimentos que sobre-
pasan el nivel de acción B o C serán considerados
como de alta probabilidad de que produzcan
impactos adversos y deberán ser sometidos a un
aislamiento subacuático o donde se permita la
fuga de lixiviados. Finalmente, aquellos que
sobrepasen el umbral de peligrosidad serán consi-
derados residuos peligrosos y tratados como tales
(CEDEX 1994; Buceta et al. 2015).
Detección de genes catabólicos en bacterias
degradadoras de hidrocarburos
Extracción de ADN total
Con el fin de purificar el ADN total a partir de
las muestras de sedimentos, se incluyó un proto-
colo de pre-extracción y luego se probaron dos
protocolos de extracción.
Pre-extracción
Las muestras fueron sometidas a un procedi-
miento que consistió en tres pasos de pre-extrac-
ción con el fin de remover los compuestos orgá-
nicos presentes en las muestras, según el protoco-
lo modificado a partir de Purohit et al. (2003):
1. Se tomó 1 g de sedimento y se agregó 1 ml de
una solución estéril con 50 mM Tris HCl pH
8,0; 200 mM ClNa; 5 mM EDTA y 0,05% (v/v)
79
PERESSUTTI Y ZORZOLI: CONTAMINANTES Y GENES MICROBIANOS: CAMPAÑA VA1219
Tabla 1. Descripción de los parámetros analizados y los métodos empleados.*Σ23 congéneres (Endrin cetona, Metoxiclor, α-
BHC, β-BHC, Lindano, δ-BHC, Aldrin, Dieldrin, Endosulfán I, Endosulfán II, Endosulfán sulfato, Endrin, Heptaclor,
Heptaclor epoxi, Hexaclorobenceno, CIS Nonaclor, 4,4’-DDE, 4,4’-DDT, 4,4’-DDD, α-Clordano, γ-Clordano, TRANS
Nonaclor, Mirex).
Table 1. Description of analyzed parameters and used methods.*Σ23 congeners (Endrin Ketone, Methoxychlor, α-BHC, β-BHC,
Lindane, δ-BHC, Aldrin, Dieldrin, Endosulfan I, Endosulfan II, Endosulfan sulfate, Endrin, Heptachlor, Heptachlor epo-
xide, Hexachlorobenzene, CIS Nonachlor, 4,4’-DDE, 4,4’-DDT, 4,4’-DDD, α-Chlordane, γ-Chlordane, TRANS
Nonachlor, Mirex).
Parámetro Método Unidad Límite de Límite de
detección cuantificación
Cr EPA SW 846 3050 B/ 6010 D mg kg-1 0,4 5,0
Cd EPA SW 846 3050 B/ 6010 D mg kg-1 0,2 0,5
Cu EPA SW 846 3050 B/ 6010 D mg kg-1 0,3 5,0
Pb EPA SW 846 3050 B/ 6010 D mg kg-1 0,4 20,0
Hg EPA 7471 B mg kg-1 0,01 0,1
HC totales (HCtot) EPA SW 846 M 3540 C / mg kg-1 2,0 5,0
EPA SW 846 M 8015 B GC-FID
PCBs totales (PCBs) ASTM D 4059:2000 μg kg-1 7,0 20,0
Atrazina (ATZ) Método Interno ALT09117 mg kg-1 0,0003 0,001
Glifosato +AMPA Método interno basado en Quppe- μg kg-1 3,0 10,0
(GLY +AMPA) EURL-SRM V11.1
Pesticidas totales (PStot)* EPA SW 846 M 8081 B μg kg-1 3,0 10,0
Triton x-100. Se agitó en vórtex y se centrifugó
a 12.000 g por 15 min. Si el residuo contenía
mucha carga oleosa se repitió este paso.
2. El sobrenadante se desechó y al pellet se le
agregó 1 ml de una solución estéril con 50 mM
Tris HCl pH 8,0; 200 mM NaCl y 5 mM
EDTA. Se agitó en vórtex y se centrifugó a
12.000 g por 15 min.
3. El sobrenadante fue desechado y al pellet se le
agregó 1 ml de una solución estéril con 10 mM
Tris HCl pH 8,0 y 0,1 mM EDTA. Se agitó en
vórtex y centrifugó a 12.000 g por 15 min. Este
último paso se repitió una vez más antes de la
extracción del ADN.
Extracción
Protocolo 1. El ADN genómico fue extraído de
acuerdo con un protocolo estándar (Ellis et al.
2003) modificado. Se inició con la adición de 1 ml
de buffer CTAB [por 100 ml: CTAB 2% (ClNa 1,4
M, EDTA 20 mM, TRIS-ClH 100 mM, pH 8,0)];
20 μl de lisozima (1 mg ml-1) y 20 μl de proteinasa
K (20 mg ml-1), al tubo Eppendorf con la muestra
de sedimento sometida a la pre-extracción. Se
mezcló por agitación en bandeja a máxima veloci-
dad por 20 min, se agregó 200 μl de SDS 10% y
se incubó por 30 min a 65 °C en baño termostati-
zado. El lisado fue recuperado y trasvasado a un
tubo limpio, manteniendo en hielo por 2 min y
luego centrifugado a 12.000 rpm por 2 min.
Luego, el sobrenadante fue transferido a un tubo
limpio y se repitió la extracción a partir del preci-
pitado obtenido, con 300 μl de buffer CTAB. Se
juntaron los sobrenadantes de ambas extracciones
y se agregaron aproximadamente 0,5 ml de fenol-
cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1; pH 8),
centrifugando luego 5 min a 12.000 rpm. Se agre-
gó al sobrenadante igual volumen de cloroformo-
alcohol isoamílico (24:1), mezclando con vortex y
centrifugando 5 min a 12.000 rpm. Posteriormen-
te, se trasvasó la fase acuosa superior (sin arrastrar
interfase) a un tubo limpio y se agregó isopropa-
nol en relación de volumen 1:1. Los tubos fueron
guardados en freezer a -20 °C 12 h. Luego de una
centrifugación durante 30 min a 12.000 rpm, el
sobrenadante fue eliminado (por volcado) y el
80 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
Tabla 2. Valores guía para cada normativa. CCME: Canadian Council of Ministers of the Environment. RGMD:
Recomendaciones para la Gestión del Material de Dragado en Puertos Españoles. ISQG/TEL: Pautas provisionales de
calidad de sedimentos marinos (ISQG)/niveles de efecto umbral (TEL), tomando como referencia sedimentos no conta-
minados. PEL: niveles de efecto probable.
Table 2. Guide values for each normative. CCME: Canadian Council of Ministers of the Environment. RGMD:
Recommendations for the Management of Dredging Material in Spanish Ports. ISQG/TEL: Interim sediment quality
guideline/threshold effect level (TEL), taking uncontaminated sediments as reference. PEL: probable effect level.
CCME RGMD
Parámetro Unidad ISQG/TEL PEL Nivel de Nivel de Nivel de Umbral de
acción A acción B acción C peligrosidad
Cr mg kg-1 52,3 160 140 340 1.000 1.000
Cd mg kg-1 0,7 4,2 1,2 2,4 9,6 72
Cu mg kg-1 18,7 108 70 168 675 2.500
Pb mg kg-1 30,2 112 80 218 600 1.000
Hg mg kg-1 0,13 0,7 0,35 0,71 2,84 17
HC totales mg kg-1 - - - - - 2.500
PCBs μg kg-1 - - 50 180 540 4.000
precipitado de ADN fue lavado con 200 μl de eta-
nol al 80% frío. Los tubos se mantuvieron a
-20 °C por 15 min y se centrifugaron 30 min a
12.000 rpm. El precipitado de ADN fue secado en
estufa a 55 °C, re-suspendido en 30 μl de agua
MiliQ estéril y almacenado a -20 °C hasta su uso.
El ADN extraído fue analizado por electroforesis
de geles de agarosa al 0,8% (p/v) en buffer TBE
0,5X (Tris: 0,044M; Ácido bórico: 0,044M;
EDTA-Na.2H2O 0,001M; pH 8,3 ±0,2), a 110 V
durante 35 min. Se utilizó 4 μl de una solución 1:3
de Lamda ADN/Hind III Markers (PROMEGA) y
agua libre de ADNasas como marcador de PM y
5 μl del extracto de ADN. Los geles fueron visua-
lizados bajo UV por tinción con bromuro de etidio
y el ADN purificado fue cuantificado con el
QuantiFluor® dsDNA system (Promega), produ-
ciendo concentraciones entre 35 and 50 ng μl-1.
Protocolo 2. En el segundo protocolo ensayado, la
extracción de ADN genómico se realizó utilizando
el kit comercial PureLink Genomic DNA Kit (Invi-
trogen) siguiendo las recomendaciones del prove-
edor. El ADN extraído fue visualizado y cuantifi-
cado como se indica en el Protocolo 1, producien-
do concentraciones entre 50 and 100 ng μl-1.
Amplificación del gen catabólico alkB mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El ADN genómico extraído fue utilizado como
molde para la amplificación de fragmentos de
genes que codifican enzimas monoxigenasas
involucradas en las vías catabólicas de hidrocar-
buros lineales, usando los sets de cebadores alkB
484F (5’-GGKCAYTTCTWCRTYGARCA-3’) y
alkB 824R (5’-CCGTAGTGYTCRABRTARTT-
3’) (Olivera et al. 2009). Las amplificaciones por
PCR fueron llevadas a cabo en reacciones de 25 μl
que contenían 50 mM de KCl; 10 mM de Tris-
HCl, pH 9,0; 0,1% (v/v) de Triton X-100; 1,5 mM
de Cl2Mg; 0,2 μM de dNTPs; 0,5 μM de cada
cebador y 1 U de ADN polimerasa T-Plus (Inbio-
Highway, Tandil) siguiendo las recomendaciones
de los proveedores para la preparación de la mez-
cla de reacción, y 5 μl del ADN. Las amplificacio-
nes se realizaron en un Ciclador Térmico Life
Express TC-96/G/H(b) con el siguiente programa:
94 °C durante 4 min; 30 ciclos de 30"a 94 °C; 45"
a 45 °C, 30"a 72 °C y una elongación final de 10
min a 72 °C. Los productos de PCR fueron verifi-
cados mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,2% (p/v), con marcador de peso molecular (100
pb, Inbio-Highway). La técnica de PCR fue opti-
mizada utilizando las siguientes temperaturas de
annealing: 45; 45,9; 47,2; 48,1 y 49,4 °C.
RESULTADOS
Detección de contaminantes
Metales pesados
El cromo fue encontrado en un rango de valo-
res entre <5,0 y 20,7 mg kg-1 y el máximo se
observó en el sitio RdP4. Ninguno de los valores
medidos sobrepasó los niveles guía en sedimen-
tos para la protección de la biota del CCME,
ni los recomendados para la RGMD en sus distin-
tos niveles de acción (Figura 2).
El cobre se halló entre no detectable y 24,6 mg
kg-1, y el valor máximo fue encontrado en el sitio
RdP4. Este es el único metal que sobrepasó el
ISQG (directrices provisionales sobre la calidad
de los sedimentos) de niveles guía en sedimentos
para la protección de la biota del CCME, pero no
superó los valores recomendados para la RGMD
en sus distintos niveles de acción (Figura 3).
El plomo se determinó en un rango de valores
entre no detectable y 26,0 mg kg-1, y el máximo
fue observado en el sitio RdP4 (Figura 4). Ningu-
no de los valores medidos sobrepasó los niveles
guía en sedimentos para la protección de la biota
del CCME, ni los recomendados para la RGMD.
Para cadmio y mercurio los resultados obteni-
dos se encontraron por debajo de los límites de
detección (<0,2 mg kg-1 y <0,01 mg kg-1, respec-
tivamente), en todos los sitios de muestreo. En
81
PERESSUTTI Y ZORZOLI: CONTAMINANTES Y GENES MICROBIANOS: CAMPAÑA VA1219
consecuencia, ninguno de los valores medidos
para estos elementos sobrepasó los niveles guía
en sedimentos para la protección de la biota del
CCME, ni los recomendados para la RGMD.
Compuestos orgánicos
Los únicos parámetros de la familia de los
compuestos orgánicos por encima de los límites
de cuantificación fueron los PCBs totales (Figura
5). Estos se encontraron en un rango de valores
entre <20,0 y 77,7 μg kg-1 y el máximo se obser-
vó en el sitio 2A. Cabe destacar que esta familia
de compuestos carece de niveles guía en sedi-
mentos para la protección de la biota del CCME
y sobrepasa el nivel de acción A recomendado
para la RGMD en un 55%.
82 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
Figura 2. Niveles de cromo. Nivel guía ISQG/TEL, recomendado por CCME (línea roja). <LC: menor al límite de cuantifica-
ción, C: cuantificable.
Figure 2. Chrome levels. Guide level ISQG/TEL, recommended by CCME (red line). <LC: lower than quantification limit, C:
quantifiable.
Figura 3. Niveles de cobre. Nivel guía ISQG/TEL, recomendado por CCME (línea roja). ND: no detectable, <LC: menor al
límite de cuantificación, C: cuantificable.
Figure 3. Copper levels. Guide level ISQG/TEL, recommended by CCME (red line). ND: non detectable, <LC: lower than quan-
tification limit, C: quantifiable.
Cromo (mg kg )
-1
Estaciones
RdP5 RdP6 RdP7 AR2RdP4UY1 UY2
<LC
C
60
40
20
0
Cobre (mg kg )
-1
Estaciones
<LC
C
25
20
15
10
5
0
ND
RdP5 RdP6 RdP7 AR2RdP4UY1 UY2
Los resultados obtenidos para hidrocarburos
totales, atrazina, glifosato +AMPA (GLY +
AMPA) y pesticidas totales se encontraron por
debajo del límite de cuantificación. Por ende, no
sobrepasaron los recomendados para la RGMD
en sus distintos niveles de acción. No se cotejaron
los resultados de éstos con los niveles guía en
sedimentos para la protección de la biota del
CCME, ya que para dichos compuestos no existe
un nivel propuesto por este organismo.
Análisis de genes catabólicos en bacterias
degradadoras de hidrocarburos
Extracción de ADN genómico
A partir de la purificación de ADN genómico,
83
PERESSUTTI Y ZORZOLI: CONTAMINANTES Y GENES MICROBIANOS: CAMPAÑA VA1219
Figura 4. Niveles de plomo. Nivel guía ISQG/TEL, recomendado por CCME (línea roja). ND: no detectable, <LC: menor al
límite de cuantificación, C: cuantificable.
Figure 4. Lead levels. Guide level ISQG/TEL, recommended by CCME (red line). ND: non detectable, <LC: lower than quan-
tification limit, C: quantifiable.
Plomo (mg kg )
-1
Estaciones
< LC
C
30
20
10
0
ND
RdP5 RdP6 RdP7 AR2RdP4UY1 UY2
Figura 5. Niveles de PCBs. Nivel guía recomendado por RGMD (línea roja).
Figure 5. PCBs levels. Guide level recommended by RGMD (red line).
PCBs (ug kg )
-1
Estaciones
ND
C
80
60
40
20
0
RdP5 RdP6 RdP7 AR2RdP4UY1 UY2
se obtuvieron bandas en ocho de las nueve mues-
tras con ambas metodologías, pero en mayor con-
centración cuando se utilizó el kit comercial
(Figura 6).
Amplificación por PCR del gen alkB
Las amplificaciones de este gen a partir del
ADN genómico purificado con el kit comercial
de Invirogen, se realizó con la temperatura de
annealing óptima de 45 °C (Figura 7). El mismo
fue detectado en las estaciones UY2, UY1, RdP4,
AR2 y AR1. Cabe destacar, que a pesar de que los
HC totales fueron hallados con valores menores a
5,0 mg kg-1, en los sitios de muestreo UY1, RdP4
y AR2 se determinaron metales pesados y en el
sitio UY1 se hallaron PCBs.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El Río de la Plata y la ZCPAU representan un
ambiente altamente productivo que incluye una
zona estuarial. Los estudios de contaminación por
compuestos tóxicos en estuarios son muy rele-
vantes ya que comprenden áreas de transición
entre el ambiente terrestre y marino, donde se
producen flujos de agua, nutrientes, partículas y
organismos desde y hacia las márgenes continen-
tales (Elliott y Quintino 2007).
Se realizaron análisis químicos preliminares
de metales pesados y compuestos orgánicos
nocivos en sedimentos, ya que dicha matriz
constituye el principal repositorio de contami-
nantes en los ambientes marinos (Marcos et al.
2012). Los resultados mostraron valores cuantifi-
cables de metales pesados en los sitios UY1,
RdP4 y AR2; y en el resto de las estaciones se
observaron valores entre detectables y no cuanti-
ficables. Dentro de los distintos contaminantes
orgánicos analizados, se cuantificaron PCBs en
los sitios UY1 y AR2. Cabe destacar, que los
sedimentos muestreados en la estación AR2
sobrepasaron el nivel de acción A, pero no el
nivel B, siendo recomendable su monitoreo
periódico. Si bien los valores de metales pesados
se encontraron por debajo de los niveles guía,
con excepción de la estación RdP4 para cobre,
algunos de ellos no estuvieron distantes de éstos.
Paralelamente, en el caso de los compuestos
orgánicos la mayoría no fueron detectables por
las técnicas de laboratorio utilizadas convencio-
nalmente; sin embargo, aquellos que estuvieron
presentes exceden los niveles guía o límites reco-
mendados en al menos un sitio de muestreo.
En estudios previos se observó que en la zona
de máxima turbidez del Río de la Plata (entre
Punta Piedras y Montevideo, Barra del Indio),
prevalecieron los aportes de materia orgánica,
donde se acumularon contaminantes antropogéni-
cos como PCBs y metales pesados (Tatone et al.
2006). Asimismo, Carsen et al. (2005) detectaron
concentraciones de cobre, plomo y cadmio en el
Río de la Plata fluvial que superaron los niveles
guía sugeridos para la protección de la biota acuá-
tica, mientras que en las zonas del Río de la Plata
fluvio-marino y el Frente Marítimo fueron leve-
mente mayores a este nivel guía. Díaz Jaramillo
et al. (2018) también confirmaron el contenido de
metales pesados en sedimentos a lo largo del gra-
diente fluvio-marino del Río de la Plata, y obser-
varon aportes sostenidos y elevados de PCBs en
la Franja Costera Sur.
Por otro lado, a pesar de que no fueron detec-
tados HC totales, existe una fuerte evidencia en
trabajos anteriores de la presencia de estos conta-
minantes en la zona de estudio. Así, Venturini et
al. (2015) hallaron mezclas complejas de HC ali-
fáticos y policíclicos, evidenciando contribucio-
nes naturales y antropogénicas (petrogénicas y
pirogénicas) en las costas del estuario del Río de
la Plata. A su vez, se encontraron n-alcanos y aro-
máticos en sedimentos de la zona de máxima tur-
bidez de la Bahía Samborombón y en Barra del
Indio (entre Punta Piedras y Montevideo)
(Colombo et al. 2005, 2006). En la Bahía Sambo-
rombón se observó la presencia de HC poliaro-
máticos con potencial tóxico y/o carcinogénico,
84 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
85
PERESSUTTI Y ZORZOLI: CONTAMINANTES Y GENES MICROBIANOS: CAMPAÑA VA1219
Figura 6. Detección de ADN genómico de sedimento colectado en la ZCPAU, utilizando el Protocolo 2, con el kit comercial
PureLink® Genomic DNA Kit. λ: marcador de ADN λ/HindIII (Thermo Scientific).
Figure 6. Genomic DNA detection from sediment collected in the AUCFZ, using Protocol 2, with commercial PureLink®
Genomic DNA Kit. λ: DNA ladder λ/HindIII (Thermo Scientific).
Figura 7. Detección del gen alkB, utilizando el Protocolo 2 de extracción de ADN genómico (kit comercial Invitrogen), con el
set de cebadores alkB848Fy alkB824R. 100pb: marcador de ADN (Inbio Highway). Electroforesis en gel de agarosa
0,8%, 110 V- 35 min, tinción con bromuro de etidio.
Figure 7. alkB gene detection using genomic DNA extraction Protocol 2 (commercial kit Invitrogen), with the primer set
alkB848Fy alkB824R. 100pb: 100pb DNA ladder (Inbio Highway). Electrophoresis in agarose gel 0.8%, 110 V- 35 min,
ethidium bromide staining.
UY3 UY2 UY1 RdP4 RdP5 RdP6 AR1AR2 RdP7
l
UY3 UY2 UY1 RdP4 RdP5 RdP6 AR2AR1RdP7100pb
generados por actividades productivas cercanas a
este ambiente estuarino, principalmente produci-
das por la combustión de petróleo (Colombo et al.
2006). Esto confirma la necesidad de abarcar
mayor número de sitios de muestreos en futuros
estudios.
Con la finalidad de controlar la evolución de
compuestos tóxicos en los sitios contaminados, es
esencial analizar las comunidades microbianas
indígenas y su contribución en los procesos de
biodegradación (Heiss-Blanquet et al. 2005). Este
objetivo puede ser alcanzado utilizando abordajes
moleculares, los cuales tienen la ventaja de ser
independientes de cultivo bacteriano y muy espe-
cíficos. Considerando que los alcanos representan
los principales componentes de los contaminantes
oleosos en el ambiente, durante este trabajo se
realizó un estudio preliminar acerca de la ocu-
rrencia del gen alkB en el área del Río de la Plata
y la ZCPAU.
El primer paso en los análisis moleculares
involucra la extracción del ADN, que en el caso
de muestras de sedimento puede ser dificultosa ya
que aún trazas de ácidos húmicos o químicos
tóxicos actúan luego como inhibidores en análisis
enzimáticos de ADN o en la amplificación de
genes específicos (Sharma et al. 2012). La mayo-
ría de los métodos reportados no contemplan la
remoción de estos compuestos, que implica el
principal problema antes de los procedimientos
de extracción de ADN (Purohit et al. 2003). En el
presente estudio, la adición de tres pasos de pre-
extracción permitió una purificación más eficaz
del ADN genómico.
A partir de este ADN purificado se amplifica-
ron genes alkB. Los genes que codifican para
diversas enzimas catabólicas, como alcano mono-
oxigenasas o dioxigenasas relacionadas con el
metabolismo de aromáticos (Iwai et al. 2011;
Guibert 2012), han sido ampliamente usados para
determinar la prevalencia de bacterias involucra-
das en la degradación de hidrocarburos. El estu-
dio de estos genes es clave para evaluar la posibi-
lidad de biodegradación en ambientes contamina-
dos (Djahnit et al. 2019). Anteriormente, se han
reportado microorganismos con capacidad de
degradar alcanos e hidrocarburos poliaromáticos
en sedimentos de la Bahía Samborombón (Izzo et
al. 2018); sin embargo, éste es el primer trabajo
sobre genes catabólicos en la ZCPAU.
La presencia del gen alkB sugiere que el uso de
alcanos como sustrato así como el potencial para
la degradación de HC representan atributos
microbianos ampliamente distribuidos en los
ambientes marinos contaminados, lo cual posibi-
lita una rápida adaptación de las comunidades
bacterianas degradadoras de alcanos y de otros
hidrocarburos (Catania et al. 2018). La detección
preliminar de genes alkB durante el presente estu-
dio indica su selección y el rol en la adaptación en
ecosistemas afectados por contaminantes de ori-
gen antropogénico. También, demuestra que estos
genes catabólicos podrían ser usados como mar-
cadores funcionales, tanto en un contexto aplica-
do como lo son las tecnologías de biorremedia-
ción, o para el monitoreo de procesos de atenua-
ción natural.
Dado el hallazgo de metales pesados y conta-
minantes orgánicos como PCBs en algunas de las
muestras analizadas, es recomendable contemplar
la inclusión de nuevas matrices como agua y
biota, así como la medición de otros parámetros
ambientales, para tener un cabal conocimiento
del estado de este ecosistema marino, que tenga
como finalidad proveer herramientas útiles en
materia de gestión para una certera toma de deci-
siones. Asimismo, la evidencia de la prevalencia
de HC en trabajos previos, confirma la necesidad
de estudios más exhaustivos, no solo de HC tota-
les sino de las fracciones alifáticas y aromáticas.
Los resultados permitieron confirmar la pre-
sencia de genes alkB en las muestras analizadas,
lo que representa el primer paso para el análisis
de genes catabólicos en ambientes marinos conta-
minados de la ZCPAU. Es importante continuar
con los estudios sobre el potencial genético, la
funcionalidad de los microorganismos y los pro-
cesos relacionados con la remediación de conta-
86 MARINE AND FISHERY SCIENCES 36 (1): 75-89 (2023)
minantes en el ambiente con objeto de relacionar-
los con la presencia de distintos contaminantes.
Este tipo de investigaciones representan un valio-
so aporte para evaluar el impacto de las alteracio-
nes antropogénicas sobre los ecosistemas marinos
y para comprender los mecanismos de la atenua-
ción natural.
Contribución INIDEP Nº 2272.
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